El análisis de mohos asociados a granos, semillas y frutos secos es de gran importancia, ya que estos microorganismos pueden establecerse desde el campo, transporte y almacenamiento y causar grandes pérdidas económicas para la industria agroalimentaria, además, de potencialmente algunas especies ser productoras de micotoxinas poniendo en riesgo la salud del humano y animales. Uno de los métodos directos más empleados para la detección, cuantificación y aislamiento de mohos en granos, semillas y frutos secos es el de placas de agar.

Figura 1. Análisis de micobiota en granos enteros.

Consiste en homogeneizar la muestra y tomar una submuestra (por ejemplo 200 granos) representativa dependiendo del tamaño del grano.

Figura 2. La muestra se pasa por el homogeneizador de Boerner.

Desinfección superficial

Desinfectar superficialmente con una solución acuosa de hipoclorito de sodio (NaOCl), en una proporción de 3/1 v/v, agitando durante un minuto, para eliminar cualquier contaminante que se encuentre sobre la superficie y determinar la micobiota endógena. La concentración del NaOCl y el tiempo de desinfección pueden variar dependiendo del tipo de la muestra y procedencia. Si se considera necesario, enjuagar por un minuto con agua destilada estéril.

Figura 3. Desinfección superficial del grano con hipoclorito de sodio.

Para la siembra de las muestras si no cuenta con una campana de flujo laminar, se recomienda trabajar en un ambiente estéril, empleando mecheros de Bunsen. Los granos previamente desinfectados se colocan en toallas de papel absorbente estériles para quitar el exceso de NaOCl y/o agua estéril. Se siembran 100 granos en cajas de Petri con los siguientes medios de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) y 100 granos en Malta Sal Agar (MSA 6%). Dependiendo del tamaño del grano y del diámetro de las cajas de Petri con medio cultivo se colocan de manera equidistante de 10 a 50 granos por placa de agar. Por ejemplo, para maíz de 15 a 20, trigo 36, sorgo 25, cacahuate 10 granos.

Figura 4. Siembra del grano entero por el método de placa agar.

Las placas con los medios de cultivo y los granos se incuban a 25°C, por un periodo de 5 a 7 días.

Figura 5. Incubación de la micobiota a 25°C.

Cuantificación y Aislamiento

Transcurrido el periodo de incubación visualmente y/o bajo un microscopio estereoscópico se cuentan las colonias de mohos que crecieron sobre los granos. Aislar y purificar cada una de las colonias de hongos considerando sus características macroscópicas (color, aspecto, consistencia, entre otras). Con la ayuda de un asa bacteriológica o una aguja de disección previamente esterilizada al fuego, tomar una pequeña parte de la colonia del moho y sembrarla en tres puntos equidistantes en una caja de Petri con medio de cultivo, con la finalidad de obtener un cultivo axénico. Para Alternaria y Fusarium se recomienda utilizar PDA y para Aspergillus y Penicillium se utiliza el medio de cultivo de Czapek (Cz).

Figura 6. Cuantificación y aislamiento de la micobiota.

Video 1: Determinación de micobiota en granos enteros

Video 2: Determinación de micobiota en granos molidos

Video 3: Micobiota asociada a maíz amarillo

Usar bata y cubrebocas.

Evitar corrientes de aire.

Al inicio y al final, limpiar el área de trabajo, con un paño con cloro y después con alcohol al 96 %.

Preparar la cantidad que vaya a utilizar de la solución de hipoclorito de sodio en una proporción 3/1 v/v, es decir, 3 ml de agua y 1 ml de cloro

Crous, P.W., Verkley, G.J.M., Groenewald, J.Z. y Samson, R.A. 2009. Fungal Biodiversity. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht, The Netherlands. 249 p.
Mathur, S.B. and Kongsdal. 2001. Common Laboratory Seed Health Testing Methods for Detecting Fungi. International Seed Testing Association (ISTA), Copenhagen, DEnmark. 425p.
Moreno, M.E., 1988. Manual para la Identificación de Hongos en Granos y sus Derivados. Universidad Nacional Autónoma de México. México, D.F. 109p.
Ulloa, M. Hanlin, R. T. 2006. Nuevo Diccionario Ilustrado de Micología. The American Phythopathological Society, Press. Minnesota, USA. 672.
Warham, E.J., Butler, L.D. y Sutton, B.C. 1996. Ensayos para la Semilla de Maíz y de Trigo. Manual de Laboratorio. CAB International. CIMMYT. México, D.F. 84p.

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Preparación de colorantes y otros medios de montaje

UNAM-DGAPA-PAPIME
Proyecto PE206620

Colaboración

Dra. María Cristina Julia Pérez Reyes
Dra. Gabriela Sánchez Hernández
M. en C. Rebeca Martínez Flores
M. en C. José Luís Garza Rivera
M.C.yT.E. Juan Espinosa Rodríguez

Dra. María Cristina Julia Pérez Reyes
Responsable de proyecto

crisp28@yahoo.com.mx

Dra. Gabriela Sánchez Hernández
Corresponsable de proyecto

gasaher@yahoo.com

Agradecimientos a:

D.G. Luz Gabriela Flores Sánchez
Ilustración digital y animación

Dra. Nallely Cano Domínguez
Colaboración y revisión de protocolos de biología molecular

Protocolo para la determinación de la micobiota en granos enteros

Introducción

Figura 1. Análisis de micobiota en granos enteros.

Granos enteros

Consiste en homogeneizar la muestra y tomar una submuestra (por ejemplo 200 granos) representativa dependiendo del tamaño del grano.

Figura 2. La muestra se pasa por el homogeneizador de Boerner.

Desinfección superficial

Figura 3. Desinfección superficial del grano con hipoclorito de sodio.

Siembra

Figura 4. Siembra del grano entero por el método de placa agar.

Incubación

Las placas con los medios de cultivo y los granos se incuban a 25°C, por un periodo de 5 a 7 días.

Figura 5. Incubación de la micobiota a 25°C.

Cuantificación y Aislamiento

Figura 6. Cuantificación y aislamiento de la micobiota.

VIDEOS

Recomendaciones

Usar bata y cubrebocas.

Evitar corrientes de aire.

Al inicio y al final, limpiar el área de trabajo, con un paño con cloro y después con alcohol al 96 %.

Preparar la cantidad que vaya a utilizar de la solución de hipoclorito de sodio en una proporción 3/1 v/v, es decir, 3 ml de agua y 1 ml de cloro

Bibliografía

Crous, P.W., Verkley, G.J.M., Groenewald, J.Z. y Samson, R.A. 2009. Fungal Biodiversity. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht, The Netherlands. 249 p.

Mathur, S.B. and Kongsdal. 2001. Common Laboratory Seed Health Testing Methods for Detecting Fungi. International Seed Testing Association (ISTA), Copenhagen, DEnmark. 425p.

Moreno, M.E., 1988. Manual para la Identificación de Hongos en Granos y sus Derivados. Universidad Nacional Autónoma de México. México, D.F. 109p.

Ulloa, M. Hanlin, R. T. 2006. Nuevo Diccionario Ilustrado de Micología. The American Phythopathological Society, Press. Minnesota, USA. 672.

Warham, E.J., Butler, L.D. y Sutton, B.C. 1996. Ensayos para la Semilla de Maíz y de Trigo. Manual de Laboratorio. CAB International. CIMMYT. México, D.F. 84p.

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UNAM-DGAPA-PAPIME
Proyecto PE206620

Colaboración

Agradecimientos a:

Introducción

Figura 1. Análisis de micobiota en granos enteros.

Granos enteros

Consiste en homogeneizar la muestra y tomar una submuestra (por ejemplo 200 granos) representativa dependiendo del tamaño del grano.

Figura 2. La muestra se pasa por el homogeneizador de Boerner.

Desinfección superficial

Figura 3. Desinfección superficial del grano con hipoclorito de sodio.

Siembra

Figura 4. Siembra del grano entero por el método de placa agar.

Incubación

Las placas con los medios de cultivo y los granos se incuban a 25°C, por un periodo de 5 a 7 días.

Figura 5. Incubación de la micobiota a 25°C.

Cuantificación y Aislamiento

Figura 6. Cuantificación y aislamiento de la micobiota.

VIDEOS

Recomendaciones

Usar bata y cubrebocas.

Evitar corrientes de aire.

Al inicio y al final, limpiar el área de trabajo, con un paño con cloro y después con alcohol al 96 %.

Preparar la cantidad que vaya a utilizar de la solución de hipoclorito de sodio en una proporción 3/1 v/v, es decir, 3 ml de agua y 1 ml de cloro

Bibliografía

Crous, P.W., Verkley, G.J.M., Groenewald, J.Z. y Samson, R.A. 2009. Fungal Biodiversity. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht, The Netherlands. 249 p.

Mathur, S.B. and Kongsdal. 2001. Common Laboratory Seed Health Testing Methods for Detecting Fungi. International Seed Testing Association (ISTA), Copenhagen, DEnmark. 425p.

Moreno, M.E., 1988. Manual para la Identificación de Hongos en Granos y sus Derivados. Universidad Nacional Autónoma de México. México, D.F. 109p.

Ulloa, M. Hanlin, R. T. 2006. Nuevo Diccionario Ilustrado de Micología. The American Phythopathological Society, Press. Minnesota, USA. 672.

Warham, E.J., Butler, L.D. y Sutton, B.C. 1996. Ensayos para la Semilla de Maíz y de Trigo. Manual de Laboratorio. CAB International. CIMMYT. México, D.F. 84p.

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