Introducción

En el pasado la taxonomía y clasificación de los hongos se basaba exclusivamente en características morfológicas, sin embargo, actualmente con el progreso de las técnicas moleculares y el descubrimiento de la reacción de polimerización en cadena (PCR), ha permitido la identificación de hongos productores de micotoxinas que no son fácil de distinguir por su morfología, además, de poder determinar si una cepa es productora de una ó más micotoxinas en particular. La PCR consiste en la amplificación exponencial de un gran número de copias de un fragmento de ADN y presenta varios requerimientos, entre los cuales es indispensable un molde de ADN, moléculas iniciadoras llamadas “primers”, una enzima de ADN polimerasa resistente a fluctuaciones de temperatura, una mezcla de desoxirribonucléotidos trifosfato, un amortiguador apropiado y un equipo llamado termociclador que tiene las características de cambiar las temperaturas dependiendo del ciclaje.

La PCR consta de tres pasos básicos: 1. Desnaturalización del ADN: sirve para separar la doble cadena de ADN a una cadena sencilla mediante temperatura (90 a 96°C), que servirá como molde para la síntesis del o los fragmentos respectivos. 2. Hibridación: en este paso la temperatura se reduce para permitir el alineamiento de las moléculas iniciadoras o “primers” a la secuencia blanco del ADN molde, las moléculas iniciadoras pueden variar en longitud, composición de bases nitrogenadas y especificidad. Estas moléculas iniciadoras o “primers” corresponden a una parte de la secuencia que se desea amplificar, es por ello que varían en composición del porcentaje de cada base nitrogenada. De acuerdo a esto su temperatura de alineamiento puede variar desde 48 a 65°C. 3. Extensión: se lleva la extensión de la molécula iniciadora mediante la enzima ADN polimerasa a 72°C. Estos tres pasos (ciclos) se repiten en el termociclador, obteniendo de manera exponencial el fragmento o fragmentos discretos sintetizados a partir del molde de ADN.

Existen diferentes metodologías para la extracción de ADN genómico para hongos. A continuación se describen dos protocolos.

Protocolo 1: Los mohos se siembran en el medio de cultivo de PDA líquido, durante cuatro días a una temperatura de 28⁰ C, con agitación constante a 100 revoluciones por minuto.

Extracción de ADN.

1. Tomar una pequeña cantidad de pellets del moho y ponerlo en un tubo de 2 ml con un balín y colocarlo en congelación ± 70⁰C un día anterior.

2. Molerlos durante cuatro minutos a 50 oscilaciones por segundo.

3. Agregar a cada muestra 500 µl de CTAB (10%), verificar que la muestra se encuentre totalmente sumergida en la solución de CTAB.

4. Homogenizar con Vortex.

5. Incubar a 65⁰ C durante 30 min.

6. Agregar 500 µl de SEVAG (cloroformo, alcohol isoamilico 24:1), mezclar suavemente mediante inversión del tubo y dejar escapar el gas. Dejar el SEVAG durante 30 min., mezclando varias veces con suavidad o usando el agitador a intensidad moderada.

7. Dejar escapar el gas que se formó.

8. Centrifugar a 9,000 rpm durante 10 min y transferir la fase acuosa (superior) a un tubo de 1.5 ml limpio y etiquetado, cuidar de no pipetear la fase aceitosa, ni los sólidos.
   Ahora se deben de recuperar los balines, lavar y esterilizar para su reutilización.
   Precipitar con 2/3 el volumen (e.g., 350 µl si se obtuvieron 500 µl de extracto) de etanol absoluto si es de material fresco o de isopropanol (2- propanol) absoluto si se trata de material de herbario.

9. El etanol/isopropanol previamente se enfría a – 20 °C.

10. Mezclar invirtiendo suavemente el tubo hasta observar precipitado, como un enturbiamiento blanquecino de la mezcla extracto – alcohol.
    Dejar reposar a -20⁰ C durante 1 hora o hasta el día siguiente.

11. Centrifugar a 13000 rpm durante 5 min., y descartar el líquido. Se forma una pastilla blanca la cual debe cuidarse que no se despegue del tubo en el momento de decantar el etanol.

12. Agregar 500 µl de etanol al 70% y centrifugar a 3000 rpm durante 3 min.
    Descartar el etanol (cuidando de no perder la pastilla).
    Secar la pastilla en una centrífuga de vacío (10 min.) o protegidos de la luz y el polvo al aire durante 2 a 3 hrs. Otra alternativa es dejar secando en un baño María a 55 °C con las tapas de los tubos abiertas, con el fin de que se evapore totalmente el etanol.
    Si el extracto estuviera muy sucio o aceitoso repetir la centrifugación con etanol nuevo antes de secar.

13. Resuspender el precipitado seco, en 50 µl de agua bidestilada (o agua inyectable) o Buffer TE 1X (Tris-Acetato-EDTA) a temperatura ambiente o precalentar a 65⁰ C.
    Mezclar bien y mantener a -20⁰ C ( o a -70⁰ C si es por periodos prolongados).

Preparación del gel de agarosa al uno por ciento.

1. Pesar 1 g de agarosa.

2. En una probeta medir 100ml de TBE1X y vaciar en un matraz.

3. Meterlo al microondas por 1min , sacar y dejar enfriar un poco. Observar si la agarosa se disolvió completamente. Si aún quedan cristales, volver a calentar en microondas por 1 minuto y repetir el procedimiento hasta que la agarosa se haya disuelto por completo.

4. Esperar que la solución de agarosa pierda calor, de manera que quede a una temperatura de 50°C.

5. Agregar 1 µl de gel Red o 7 µl del stock de bromuro de etidio a una concentración de 10 mg/mL.

6. Vaciar el gel a la cámara de electroforesis. Poner un peine para que se formen los pozos que se utilizarán en el gel. El número de pozos será de acuerdo al número de muestras.

7. Se deja solidificar a temperatura ambiente aproximadamente 20 min.

Colocación de las muestras de ADN

1. En una tira de parafilm colocar las muestras.

• 1.1. Colocar 2 µl de Buffer de carga (Bromo-fenol-azul).

• 1.2. Más 2 µl de la muestra.

• 1.3. Y al final una mancha de 4 µl escalera (de ADN digerido).

2. Colocación de las muestras en la placa de agarosa.

• 2.1. Colocar la placa de agarosa en la cámara de electroforesis.

• 2.2. Colocar el buffer de carga más la muestra en cada uno de los pozos de la placa de agarosa y en el último pozo se coloca la escalera

• 2.3. Se corre a 80 volts durante 20 min.

• 2.4. Después la placa de agarosa se coloca en el transiluminador para leer la placa

Preparación para PCR

Para la identificación taxonómica de hongos, se han utilizado herramientas genéticas bastante eficientes como la PCR. Generalmente se utilizan secuencias pequeñas de nucleótidos en uno de los tres loci usados como marcador “DNA barcoding” (codificador de ADN). Estas secuencias que se utilizan como marcadores son las ITS (por sus siglas en inglés “Internal Transcribed Spacer” o Espaciadores Transcritos Internos), las cuales presentan una alta variabilidad en secuencia. Estas secuencias generalmente se encuentran codificadas entre los genes codificantes del rRNA. Una vez que se ha obtenido el ADN del hongo a identificar, se utiliza como “templado” para hacer la reacción de PCR.

1.- La reacción se prepara de la siguiente manera:

Reactivo	Volumen (µL)
Buffer 10 X	2.5
MgCl2	1
dNTPs 10 mM	0.5
ITS4 (Primer forward)	0.25
ITS5 (Primer reverse)	0.25
ADN (muestra que funcionará como “templado”)	200 ng*
Taq polimerasa	0.25
H2O libre de nucleasas	Llevar a volumen de 25 µL

Esta mezcla corresponde a una reacción de PCR. Para preparar más reacciones, se multiplican todos estos volúmenes (excepto el del DNA) para una muestra por el número de reacciones a correr más uno. Esa Master Mix se reparte en cada tubo y al final se agrega la muestra de ADN.

2.- Los tubos se colocan en el termociclador. La duración de la reacción estará en función del programa que se utilice para la amplificación del fragmento. El programa a utilizar en este protocolo es el siguiente: Desnaturalización inicial a 94 °C por 4 min; seguida por 35 ciclos a 95 °C y un min, templar a 58 °C por un minuto, extensión a 72 °C por 2 min, y extensión final por 10 min; mantener a 4 °C.

3.- Una vez que el programa de amplificación finalizó las muestras se corren en un gel de agarosa al 1% para verificar la amplificación de los fragmentos (como se indicó anteriormente).

4.- Finalmente se procede a secuenciar.

Protocolo 2

1.- Se debe obtener suficiente biomasa para realizar la extracción de DNA de los hongos filamentosos como sigue:

* Para la extracción de DNA

• Inocular en una caja Petri con 30 ml de medio mínimo líquido suplementado una “asada” de esporas.

• Dejarlas incubando a 37 °C de 16-18 h sin agitación. Es importante no pasarse de este tiempo porque se pueden acumular carbohidratos que interfieren en la extracción de DNA.

2.- Después del periodo de incubación (16-18 h) se colecta el micelio que haya crecido con unas pinzas, se coloca en una toalla de papel secante y se retira el exceso de humedad, hasta que quede totalmente seco.

3.- El micelio seco se transfiere a un tubo de 1.5 ml y se sumerge al nitrógeno líquido. Si no se cuenta con nitrógeno líquido, se puede congelar durante 3 h a -80 C^o.

4.- Los tubos se colocan en una centrífuga que tenga un sistema de vacío o en una liofilizadora*. En el caso de la centrífuga con vacío, se dejan 4 h. Si se dejan en la liofilizadora, se dejan secar toda la noche. Después de este tratamiento, el micelio queda como una “hojuela crujiente”, el cual se tritura con una espátula, tallando las hojuelas contra la pared del tubo hasta que quede como un polvo fino.

* Si es el caso que no se cuenta con una centrífuga con vacío o una liofilizadora:

1. Después de quitar el exceso de humedad con una toalla de papel secante, se coloca el micelio seco envuelto en aluminio y se sumerge al nitrógeno líquido.

2. Se deja la muestra 20 segundos y se saca del nitrógeno líquido con unas pinzas.

3. Después se retira el aluminio y el micelio congelado se coloca en un mortero.

4. Inmediatamente se agrega nitrógeno líquido al mortero y se rompe con el pistilo, cuidando que la muestra tenga nitrógeno líquido y que no se descongele en todo el proceso de rompimiento del micelio. La muestra se tritura hasta que quede como un polvo fino.

5. Posteriormente se deja en hielo hasta el paso 7.

5.- Preparar el buffer de extracción fresco de la siguiente manera:

EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; SDS = dodecilsulfato sódico (lauril sulfato sódico); DEPC = dietil pirocarbonato

Buffer de Extracción
1 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0
200 µl de SDS 10 %
10 µl DEPC

6.- Aforar a 10 ml. Dejar agitando mínimo 15 minutos para que el DEPC se homogenice en la mezcla.

7.- Agregar 600 µl de buffer de extracción a cada tubo e incubarlos a 68 °C en un baño María durante 30 minutos. Durante este tiempo, procurar mezclar el micelio y el buffer de extracción con el Vortex.

8.- Retirar los tubos del baño a 68 °C e inmediatamente centrifugarlos a 10 000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos.

9.- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y agregar 50 µl de 8M de acetato de potasio pH 5.2.

10.- Mezclar muy bien con el Vortex y colocar en hielo durante 10 minutos.

11.- Centrifugar a 10 000 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos.

12.- Transferir el sobrenadante a un tubo fresco.

13.- Agregar 600 µl de isopropanol y mezclar. Puede mejorar la extracción si se deja con el isopropanol en hielo durante 5 minutos.

14.- Centrifugar 10 minutos a 12 000 rpm a temperatura ambiente.

15.- Eliminar el sobrenadante y conservar la pastilla. Agregar 300 µl de buffer TE o agua estéril destilada o libre de nucleasas y calentar la muestra en un baño María a 68 °C durante 1 h. Durante este tiempo, mezclar con Vortex por breves periodos con el fin de que se disuelva la pastilla.

16.- Centrifugar 5 minutos a temperatura ambiente a 10000 rpm y transferir en sobrenadante a un tubo fresco.

17.- Agregar 800 µl de etanol al 95% y 15 µl 10M de cloruro de litio, mezclar bien e incubar a 4 °C durante 5 minutos. El cloruro de litio ayuda a precipitar mejor el DNA, pero se puede prescindir de él.

18.- Centrifugar 5 minutos a 10 000 rpm a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.

19.- Agregar 300 µl de etanol al 70 %, mezclar con Vortex y centrifugar 5 minutos a 10 000 rmp a temperatura ambiente. Repetir este paso dos veces.

20.- Descartar el sobrenadante e invertir el tubo para retirar por completo el etanol restante. Dejarlos invertidos sobre una toalla de papel secante durante 5 minutos o hasta que se seque completamente la pastilla. También se puede optar por secarlos en un baño María a 55 °C durante 5 minutos. Es muy importante no dejarlos secar demasiado porque después será muy difícil disolver la pastilla en el siguiente paso.

21.- Resuspender la pastilla en 100 µl de agua destilada estéril o libre de nucleasas/ TE 1X.

22.- Cuantificar y correr en un gel para verificar que el DNA se encuentre en buenas condiciones.

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