Es de bajo costo, el tiempo de conservación es menor de dos años; tiene como desventaja que las cepas con las resiembras continuas, pueden mutar y perder su capacidad para producir toxinas.

Metodología de repique o transferencias periódicas

• Preparar agar inclinado (PDA, AA, EMA) en tubos de cultivo con tapón de rosca.

• Sembrar el moho en tubos con medio e incubarlo a una temperatura de 25°C durante siete días.

• Posteriormente almacenar los tubos a 5°C.

• Etiquetar con los datos del hongo y la fecha de almacenamiento.

• También se pueden cubrir con aceite mineral estéril aproximadamente 10 mm por arriba del nivel del agar.

El tiempo de conservación es de dos a diez años, es de bajo costo y pueden ser por desecación (en gel de sílice, perlas de vidrio, papel filtro, entre otros); en suelo; en tejido vegetal deshidratado y en suspensión en agua estéril.

Conservación en suelo.

Es una técnica de bajo costo usada para cultivos que producen esporas y estructuras de resistencia; las cepas pueden almacenarse en diferentes sustratos. El método consiste en esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado como medio absorbente para una pequeña cantidad de inóculo; preserva la viabilidad y características de los mohos por ejemplo, especies de Penicillium, Aspergillus, Alternaria. Se mantienen viables en un periodo de 3 años a temperatura ambiente y más de 8 años a temperatura de 5°C.

Metodología.

• Colectar suelo de jardín, y llenar un tercio de un tubo de cultivo (20 – 30 ml) con 20% de agua.

• Esterilizar los tubos con el suelo durante dos días consecutivos a 15 libras de presión, 120 °C durante 20 minutos.

• Preparar una suspensión de esporas en agua destilada estéril y adicionar 1 ml de la suspensión en los tubos con suelo previamente esterilizados (realizarlo por triplicado para cada cepa).

• Etiquetar el tubo con los datos del hongo y fecha de almacenamiento.

• Incubar a una temperatura de 25 °C por cinco días y posteriormente almacenar en un refrigerador a 4 – 7 °C.

• Determinar la viabilidad a intervalos adecuados de tiempo (anualmente), tomando una pequeña porción de suelo y sembrar un medio de cultivo adecuado e incubar bajo condiciones óptimas de crecimiento.

Es un método de bajo costo y se ha empleado en la conservación de mohos y levaduras. Los porcentajes de viabilidad son altos y el periodo de almacenamiento es aproximadamente de dos a siete años. Consiste en suspender en agua estéril estructuras de reproducción asexual y sexual, así como estructuras de resistencia.

Metodología.

• Esterilizar 10 ml de agua destilada en tubos de cultivo a 15 libras de presión, 120 °C durante 20 minutos.

• Cortar pequeños bloques de agar (5 mm3) del borde de la colonia del hongo.

• Transferirlos a los tubos de cultivo (5-8); cerrar el tubo y cubrir con un pedazo de ParaFilm M (American National Can, Neenah, WI).

• Etiquetar con los datos del hongo y fecha de almacenamiento.

• Almacenar en un refrigerador a 5 - 7 °C.

• Determinar la viabilidad a intervalos adecuados de tiempo (semestralmente), sembrando un pequeño bloque en un medio de cultivo adecuado e incubar bajo condiciones óptimas de crecimiento.

Es un método más sencillo para conservar los mohos como Fusarium. Los cultivos preservados de esta manera permanecen viables varios años, dependiendo de la especie de hongo y las condiciones de almacenamiento, es un método más económico y sencillo que el de criocongelación y liofilización.

Metodología.

• Colocar en tubos de cultivo 3 ml de leche descremada en polvo (Svelty Nestlé) diluida en agua destilada al 7% y esterilizar a 121 °C durante 13 minutos, dejar enfriar y almacenar en refrigeración hasta su uso.

• Esterilizar en un horno de convección viales (15 x 50 mm) con cristales de sílice aproximadamente 2/3 partes de su volumen a 180°C durante 90 minutos con la rosca floja, al finalizar la esterilización cerrarlos.

• Preparar una suspensión de conidios y micelio a partir de una colonia con esporulación abundante en los tubos con la leche previamente esterilizada. Agitar en un Vórtex durante 30 segundos.

• Tomar con una pipeta estéril 0.5 a 0.7 ml de la suspensión del hongo con la leche y verter en un vial con los cristales de sílice y homogeneizar con la misma pipeta. Es importante durante este proceso mantener los viales en un baño de hielo.

• Cerrar las tapas y agitar en un Vórtex 5 s y seguir manteniendo en el baño de hielo.

• Posteriormente mantener los viales inoculados en un desecador durante una semana con las tapas ligeramente flojas.

• Cerrar los viales y cubrir con un pedazo de ParaFilm M (American National Can, Neenah, WI), almacenar en un refrigerador a 4 – 7 °C

• Probar la viabilidad del hongo a intervalos adecuados de tiempo (anualmente) sembrando algunas perlas de sílice en un medio de cultivo y temperatura adecuados para su desarrollo.

Es un proceso de conservación de cepas de mohos en donde se emplean temperaturas bajas. La ventaja es que los mohos se pueden conservar por un tiempo prolongado; sin embargo, los aparatos y materiales son muy costosos. Los mohos pueden ser preservados a temperaturas de -5 a -20°C por uno a dos años por congelación en cultivos líquidos o en suspensión en viales. Para los procesos de congelación a temperaturas más bajas se requiere de crioprotectores como el glicerol, cuando son almacenados a -70° C o en nitrógeno líquido de -156 a -196 °C.

Metodología
Conservación por congelación a -70°C

• Preparar medio de cultivo de papa dextrosa con 25 % de glicerol (PDG).

• Con una pipeta vaciar en vial de 7 ml, 2 ml del medio y en crioviales de polipropileno de 2 ml verter 1 ml.

• Esterilizar los viales en la autoclave a 15 lb de presión, 121 °C por 15 min.

• Con un asa bacteriológica estéril de cada moho identificado se realiza un raspado de la colonia y se coloca en vial de 7 ml con medio de cultivo para obtener una suspensión de hifas y conidios.

• Posteriormente 0.5 ml de la suspensión es recolectada mediante una micropipeta y se coloca en el criovial que contiene 1 ml del medio de cultivo y se conserva a -70 °C.

Los tubos Eppendorf que contienen la suspensión de esporas se sumergen en nitrógeno líquido a una temperatura de -196°C o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido con una temperatura de -140°C.

Metodología

• Preparar una suspensión de conidios en glicerol estéril al 10% (v/v).

• En un criovial de polipropileno de 2 ml colocar 0.5 ml de la suspensión, etiquetar y dejar a temperatura ambiente por un periodo de 1 hora para permitir que los conidios se equilibren con el glicerol.

• Bajar la temperatura hasta -50 °C, a un intervalo óptimo de -1 °C por minuto.

• Cuando los criotubos alcancen los -50 °C, colocarlos en varillas de aluminio o cajas criogénicas en los recipientes del tanque criogénico y sumergir en el nitrógeno líquido hasta alcanzar una temperatura final de almacenamiento de -196 °C.

• Para probar la viabilidad a los 4 días descongelar un criotubo a baño María a 37°C. Sacarlo en cuanto el hielo se haya descongelado. No permitir que las suspensiones alcancen la temperatura del baño.

• Sembrar en un medio de cultivo adecuado e incubar bajo condiciones óptimas de crecimiento.

Este método de conservación para hongos consiste en congelar una suspensión conidial y remover el agua por ebullición mediante vacío. Los liofilizadores están compuestos por tres partes, un mecanismo de congelamiento, una fuente de vacío y una trampa para el vapor de agua. Se mantienen entre 0 y 5°C y el periodo de viabilidad para algunos hongos es aproximadamente de 23 años.

Metodología

• Los hongos que van a ser almacenados deben ser cultivados en placas con medios de cultivo apropiados para su desarrollo y esporulación.

• Adicionar 1.5 a 2.0 ml de un lioprotector estéril (leche descremada, glicerol, etc.) a la placa de agar y raspar ligeramente la superficie de la placa con una pipeta Pasteur para resuspender las esporas.

• Aproximadamente 200 µl de la suspensión de esporas son vertidos a los tubos de liofilización previamente esterilizados y se meten al colector de vacío.

• El colector se introduce hasta que los tubos de liofilización quedan inmersos en el baño de hielo seco y etilenglicol, se mantienen por aproximadamente 5 minutos, en donde la temperatura descenderá de 40 a - 50°C.

• Posteriormente se aplica vacío al sistema por 30 minutos mientras el baño llega a 0°C. El colector se eleva para sacar los tubos del baño.

• Se continúa con el proceso de secado de liofilización a temperatura ambiente hasta que la presión del sistema alcanza aproximadamente 30 milliTorrs.

• El enfriamiento por evaporación conserva las muestras congeladas durante el proceso de secado.

• Los tubos después son sellados al vacío y finalmente se almacenan en cajas de plástico o bolsas selladas en refrigeración a 4 °C.

• La pureza y viabilidad se pueden probar 1 o 2 semanas después de ser almacenados. Considerando una viabilidad baja (10-50 colonias/tubo), moderada (50-100 colonias/tubo) y alta (100-1000 colonias/tubo). Este método es útil para conservar especies de los géneros Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Alternaria, Mucor, Candida y Rhodotorula.

• Mier, T., Toriello, C., Ulloa, M. 2002. Hongos Microscópicos Saprobios y Parásitos: Métodos de Laboratorio. Biológicas y de la Salud: Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco y el Instituto de Biología, UNAM. México, D.F. 90p.

• Nakasone, K. K., Peterson, W. S, y Jong, Shung-Chang. 2004. Preservation and distribution of fungal cultures. p. 37-47. In: Mueller, M. G., Bills, F. G., and Foster, S.M. Biodiversity of Fungi. Inventory and Monitoring Methods. Elsevier, Academic Press. California, USA.