Las micotoxinas son sustancias sintetizadas por hongos filamentosos producto de su metabolismo secundario. La toxicidad de las micotoxinas ocurre incluso a concentraciones muy bajas, por eso se necesitan métodos sensibles y fiables para su detección. Los análisis de micotoxinas que realizan algunos laboratorios se basan a menudo en métodos fisicoquímicos como la cromatografía de capa fina (Thin-Layer Chromatography, TLC). La TLC ha sido el primer método de elección para la investigación y determinación de micotoxinas. Sin embargo, ahora existen numerosos métodos analíticos que pueden ser usados para la determinación de diversas micotoxinas en diferentes alimentos y piensos, algunos de estos métodos han sido estudiados de manera colaborativa por diversas asociaciones internacionales y con base en los resultados han sido incluidos como métodos oficiales. Los cuales pueden ser presuntivos por su fluorescencia, como en el caso de las aflatoxinas en cereales contaminados. Así como los analíticos de referencia por cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), cromatografía de gases (GC) y espectrometría de masas (MS) y técnicas comerciales inmunológicas basadas en anticuerpos específicos policlonales y monoclonales como la de enzimoinmuno análisis de absorción (ELISA) y la de columnas de inmunoafinidad (IAC). En los últimos años se ha empleado la espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS).

Una vez obtenida una muestra representativa de un lote, es necesario prepararla para su análisis.

El tamaño de la muestra debe de ser 1 a 5 kilogramos (kg), mezclar la muestra en un divisor de grano varias veces, quebrar el grano en un molino eléctrico para reducir el tamaño de partícula de manera que pueda pasar por una criba estándar Núm. 14, mezclar para uniformizar, otra vez moler para reducir el tamaño de las partículas de harina, que pase por una criba Núm. 20, mezclar en una batidora, durante 15 minutos, colocar las muestras en bolsas de papel y guardar en congelación hasta su análisis químico.

Método Múltiple para Zearalenona, Aflatoxinas y Ocratoxinas propuesto por Eppley, 1968

Empaque de la columna de cromatografía

En una columna de vidrio para cromatografía de 22 X 300 mm, colocar una pequeña borla laxa de fibra de vidrio en la base de la columna, agregar 5g de sulfato de sodio anhidro (Na₂SO₄) grado analítico, para dar una base al gel de sílice, adicionar cloroformo (CHCL₃) hasta la mitad de la columna, agregar 10 g de gel de sílice, agitando para dispersar el gel, dejar asentar, drenando algo del CHCL₃, pero sin dejar secar el gel, agregar lentamente 15 g de Na₂SO₄ anhidro y drenar el CHCL₃ hasta que sólo cubra la superficie del Na₂SO₄.

Extracción química

En un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio de 500 ml pesar 50 g de la muestra, agregar 25 ml de agua destilada, 25 g de tierra de diatomeas y 250 ml de cloroformo CHCl3, (grado analítico). Agitar 30 min en agitador de acción de muñeca (Burrel Mod. 75), o tres minutos en licuadora a alta velocidad, emplear licuadora a prueba de explosión (Figuras 1-4).

Filtración

Pasar la muestra a través de papel filtro Whatman Núm.1 plisado o equivalente en un embudo de vidrio de 150 mm de diámetro. Colectar en una probeta de 500 ml, los primeros 50 ml (Figuras 5-7).

Purificación

Los primeros 50 ml del filtrado se pasan a través de la columna de cromatografía de gel de sílice.
Eluir con 150 ml de hexano, continuar con 150 ml de benceno (grado analítico) y desechar (flujo máximo, cuidando que no se seque la columna).

Primera fracción

La fracción de zearalenona se eluye, con 250 ml de acetona /benceno 5/95 v/v, en matraces de fondo redondo de 500 ml. Lavar columna con 150 ml de éter etílico y desechar.

Segunda fracción

Eluir las aflatoxinas con 150 ml de metanol / cloroformo 3:97 v/v en matraces de fondo redondo de 250 ml.

Tercera fracción

Eluir las ocratoxinas, con 250 ml de ácido acético glacial/benceno 1/99, v/v en matraces de fondo redondo de 500 ml (Figuras 8-9).

Figuras 8-9. Purificación y elución de zearalenona, aflatoxinas y ocratoxinas.

Evaporación

Evaporar las tres fracciones obtenidas de la columna en rotavapor (Buchi 011 RE111) con baño de vapor (Buchi 461) a 30°C hasta casi sequedad. Colectar las dos fracciones de acetonitrilo (capa inferior) en un matraz de fondo redondo y evaporar hasta sequedad. El residuo de la evaporación de las aflatoxinas y ocratoxinas se transfiere a viales de 20 ml, lavar las paredes del matraz con 10 ml de CHCL3, repartido en tres lavados. El contenido de los viales, se evapora a sequedad en un baño de vapor en atmósfera de nitrógeno y se conservan en congelación hasta el momento de su uso en la cromatografía de capa fina.

Para la fracción de zearalenona se lleva a cabo un paso de partición (26:114) para eliminar los residuos de grasas y pigmentos del extracto (AOAC, 1984). Transferir el residuo de la evaporación a un embudo de separación y lavar 4 veces con 10 ml de benceno y dos veces más con acetonitrilo, primero con 10 y luego con 5 ml. Agitar el embudo de separación y dejar separar las capas. Colectar las dos fracciones de acetonitrilo (capa inferior) en un matraz de fondo redondo y evaporar hasta sequedad. Lavar el matraz con 10 ml de CHCL3 y transferirlo a un vial y evaporarlo a sequedad en baño María y en atmósfera de nitrógeno (Figuras 10-13).

Figuras 10-13. Evaporación de las muestras

Cromatografía en capa fina

Placas preliminares

La cromatografía de capa fina se realiza en placas de vidrio de 20 x 20 cm, precubiertas con gel de sílice con un espesor de 0.25 mm (Merck 5721) o cromatoplacas precubiertas con indicador de fluorescencia (Merck).

Aflatoxinas

Resuspender con 200 µl de benceno / CH₃CN 98/2, v/v y agitar durante un minuto en un Vortex.
Hacer las manchas con una microjeringa de 10 µl, colocar dos manchas de 5 µl de la muestra sobre una línea imaginaria a 4 cm del borde inferior de la placa. En esa misma placa colocar manchas de 2, 4 y 8 µl de la solución estándar de aflatoxinas (B1, B2, G1 y G2) y sobre una mancha de 5 µl de la muestra colocar una mancha de 4 µl de la solución estándar como patrón interno.
Las placas se desarrollan en un tanque no equilibrado, ni saturado, con un sistema de solventes acetona / cloroformo, 9 / 1 v/v, durante 40 min a 23-25°C.
Dejar secar la placa y observar bajo luz ultravioleta de onda larga (360nm).
Las aflatoxinas se observan de color azul (B1 y B2) y verde (G1 y G2), tomando como referencia las manchas de los estándares.

Ocratoxinas

Resuspender con 0.5 ml de ácido acético glacial/ benceno, 1/99 v/v. Agitar durante un minuto en Vortex. Las manchas en la placa se aplican igual que para aflatoxinas. El estándar es para ocratoxina A y sistema de solventes es ácido acético glacial / benceno, 5/45 v/v. durante 40 min a 23-25°C.
Observar bajo luz ultravioleta de onda larga (360nm).
Identificar las ocratoxinas como manchas verdosas, tomando como referencia las manchas de los estándares.

Zearalenona

Agregar 0.5 ml de benceno, agitar durante un minuto en Vortex.
Colocar dos manchas de 10 µl en la placa. En la misma placa se colocan las manchas del estándar 2, 4 y 8 µl y sobre una de las manchas de 10 µl de la muestra se coloca una mancha de 4 µl del estándar como patrón interno.
El estándar es para zearalenona, las placas se desarrollan en un tanque no equilibrado, ni saturado, con un sistema de solventes de etanol/cloroformo (5/95 v/v) durante 40 min.
Las placas ya secas se observan bajo luz ultravioleta de onda corta (260 nm).
Las manchas positivas se observan con una tonalidad azul, tomando como referencia las manchas de los estándares.

Placas cuantitativas

En estas placas sólo se colocan las muestras positivas detectadas en las placas preliminares, y en las concentraciones estimadas con base en los resultados obtenidos por comparación visual de la placa preliminar para aflatoxinas, ocratoxinas y zearalenona.
Si la placa preliminar sugiere una nueva concentración del extracto de la muestra, evaporar y redisolver en el volumen benceno / CH₃CN, 98 / 2, v/v.
Con una microjeringa de 50 µl se colocan sucesivamente tres manchas de cada muestra (3.5, 5, 6.5 µl), en la misma placa se colocan manchas de 2, 4 y 8 µl de solución estándar, si las manchas de las muestras son muy tenues en la placa preliminar aumentar a (± 10, 20 y 30 µl). Desarrollar igual que en la placa preliminar (Figuras 14-17).

Cálculo de la concentración de aflatoxina B1

La cuantificación se realiza de acuerdo con la siguiente fórmula (26.031) AOAC. (2016).

µg toxina/kg muestra = (SxYxV) / XxW)

En donde:
S= µl estándar aflatoxina B1 igual al problema.
Y= concentración del estándar de aflatoxina B1 µg /ml.
V= µl de la dilución final del extracto de la muestra.
X= µl extracto de la mancha de la muestra con intensidad de fluorescencia igual a S (estándar B1).
W= gramos de muestra aplicados a la columna.
Calcular B2, G1, G2, zearalenona y ocratoxinas igual que para aflatoxina B1.

Pruebas confirmatorias

Para confirmar la identidad de las toxinas detectadas se realizarán las siguientes pruebas.

Aflatoxinas:

Asperjar la placa con una solución de ácido sulfúrico/ agua, 1 /3 v/v. Las manchas de aflatoxinas cambian de tonalidad azul a una amarilla, cuando se observan con luz ultravioleta de onda larga. Si la mancha no presenta este viraje no se trata de aflatoxinas.

Ocratoxinas

Asperjar la placa con una solución alcohólica de bicarbonato de sodio al 1%. Las manchas de ocratoxinas deben virar de tonalidad verdosa a una azul intenso cuando se observan bajo luz ultravioleta de onda larga (360nm).

Zearalenona

Asperjar la placa con una solución de cloruro de aluminio (20 g Cl3Al/ 100 ml OH), la placa se calienta por 5 min 130 °C. Las manchas de zearalenona dejan de ser perceptibles cuando se observan bajo luz ultravioleta de onda corta (260nm), pero reaparecen con una tonalidad azul cuando se observan bajo luz ultravioleta de onda larga (360nm).

Reporte de resultados

Los resultados se pueden reportar de diversas formas, por ejemplo, elaborando tablas o cuadros y gráficas.

Extracción

• En una licuadora colocar 50 g de la muestra (sorgo, cebada, trigo, maíz, etc.), con 250 ml de metanol y mezclar durante tres minutos a máxima velocidad.

• Colectar los primeros 30 ml del extracto y pasar a través de papel filtro (Whatman No. 2).

• El filtrado se coloca en un embudo de separación de 250 ml y se le adicionan 60 ml de sulfato de amonio al 20% y 30 ml de hexano, agitándose el embudo durante 60 s.

• Posteriormente dejar separar las capas y la fase acuosa de sulfato de amonio/metanol pasarla a otro embudo de separación de 250 ml.

• Para alternariol (AOH) y monometil éter de alternariol (AME) extraer dos veces con 5 ml de cloruro de metileno, recibiendo los extractos combinados en un vial (20 ml).

• Para el análisis de ácido tenuazónico (TeA) la fase acuosa de amonio/metanol se ajusta a un pH 2 con HCL 6 N y se extrae dos veces con 50 ml de cloruro de metileno, dejar separar las capas y extraer la fase acuosa.

• Posteriormente agregar 30 ml de bicarbonato de sodio al 5% y extraer 2 veces con 2 ml de cloruro de metileno.

Concentración

• Las fracciones obtenidas de la fracción se evaporan a sequedad en baño de vapor, en atmósfera de nitrógeno y se conservan en congelación (-20°C) hasta su uso.

Cromatografía de capa fina

• Resuspender las fracciones de micotoxinas obtenidas de AOH, AME y TeA en 200 µl de benceno acetonitrilo (98/2 v/v) o en 1000 µl de metanol agitándose durante un minuto en un Vortex.

• De cada muestra analizada con una jeringa de 50 µl colocar del extracto final dos manchas de 25 µl, sobre una línea imaginaria a 2.5 cm del borde inferior de una placa de gel de sílice 60 activada por una hora a 150°C o cromatoplacas de aluminio recubiertas con indicador de fluorescencia.

• Sobre una de las manchas de 25 µl de muestra, adicionar una mancha de 10 µl de cada una de las soluciones patrón.

• En el centro de la placa colocar tres manchas de 25, 50 y 75 µl, respectivamente, de una solución patrón de AOH, sobre estas tres manchas patrón se adicionan otras manchas de 2, 6 y 10 µl de solución patrón de AME y finalmente otras tres manchas de TeA 25. 50 75 µl.

• Desarrollar las placas dentro de un tanque, no saturado, ni equilibrado, con cloroformo/acetona (88/12 v/v) durante 50 min aproximadamente.

• Las placas ya secas se observan bajo luz ultravioleta (254 y 365 nm).

• Las muestras positivas presentan un brillo y un Rf similar a las manchas de las soluciones patrón.

Bibliografía

• Seitz, L.M. y Mohr H. E. 1976. Analysis of Alternaria metabolites by high-pressure liquid chromatography. Anal Biochem, 70:224-230.

• Thuong T.T. Nguyen, Jueun Kim, Sun Jeong Jeon, Chul Won Lee, Naresh Magan, Hyang Burm Lee. 2018. Mycotoxin production of Alternaria strains isolated from Korean barley grains determined by LC-MS7MS. International Journal of Food Microbiology. 268:44-52. DOI:1016/j.ijfoodmicro.2018.01.003

• Pesar 50 g de la muestra.

• Colocarlos en un vaso de licuadora, adicionar 5 g de cloruro de sodio (NaCl) y 100 ml de metanol al 80% (80 metanol / 20 ml agua destilada).

• Moler por un minuto a máxima velocidad.

• El extracto obtenido se hace pasar a través de un embudo con papel filtro Whatman No. 1 aflautado.

• El filtrado resultante se colecta en una probeta de 100 ml.

• Tomar 10 ml del extracto filtrado con una pipeta y colocarlo en un vaso de precipitados con 40 ml de agua destilada.

• Homogenizar la dilución y pasar el extracto diluido a través de un filtro de fibra de vidrio (1.5 µM) y colectarlo en un vaso de precipitados.

• Tomar 10 ml del filtrado del extracto diluido y pasarlo a través de la columna de afinidad Afla Test-P con anticuerpos monoclonales, a una velocidad de 1 a 2 gotas por segundo (s); previamente colocada en el dispositivo llamado “bomba”.

• Pasar 10 ml de agua destilada a través de la columna, a una velocidad de 1 a 2 gotas /s. Este paso se hace por duplicado.

• Posteriormente para eluir la muestra se pasa 1 ml de metanol HPLC a través de la columna (1 a 2 gotas /s).

• Esta última fracción se colecta en un vial de borosilicato, al cual se le adiciona 1 ml de revelador Afla Test.

• Se homogeniza la mezcla en un Vortex por 5 segundos, posteriormente se limpia el vial con un papel seda y se introduce en un Fluorómetro Marca VICAM serie 4 calibrado previamente con el estándar utilizado para la lectura de concentración de aflatoxinas totales.

• Finalmente se toma la lectura de aflatoxinas totales después de 60 s.

Bibliografía

• https://www.vicam.com/category/aflatoxin-testing-solutions

• Pesar 50 g de maíz y colocar en un vaso de licuadora. Agregar 5 g de cloruro de sodio y 100 ml de metanol/agua destilada al 80% (80/20 v/v).

• Moler por un minuto a máxima velocidad.

• Pasar la muestra a través de papel filtro aflautado y recolectar el extracto.

• Tomar con una pipeta 10 ml del extracto y diluirlo con 40 ml de buffer de lavado (0.1% Tween – 20/PBS) y homogeneizar.

• El extracto diluido se filtra a través de papel fibra de vidrio (1.0 µm).

• Pasar 10 ml del extracto diluido y filtrado a través de la columna de afinidad FumoniTest lentamente de 1 a 2 gotas/s (colocada en la jeringa del dispositivo llamado Bomba)

• Después pasar 10 ml del buffer de lavado (0.1% Tween-20/PBS) de 1-2 gotas/s.

• Posteriormente pasar otros 10 ml de Buffer de PBS a través de la columna (1 a 2 gotas/s).

• Agregar 1.0 ml de metanol grado HPLC y eluir la muestra (1 a 2 gotas/s).

• Colectar el extracto en un vial y adicionar 1 ml de revelador A y B al vial. Homogeneizar en un Vortex.

• Limpiar el vial con papel seda y colocarlo en el Fluorómetro. Después de 240 s obtener la lectura de fumonisinas totales.

Bibliografía

• https://www.vicam.com/category/aflatoxin-testing-solutions

1. El examen de la luz negra debe hacerse en un cuarto oscuro o en una cámara oscura, con luz ultravioleta de longitud de onda de 365 nm.

2. Una vez obtenida una muestra representativa de un lote.

3. El grano debe de quebrarse en un molino eléctrico antes de su inspección con la luz negra.

4. Los granos quebrados se deben observar desde varios ángulos para evitar perder las partículas fluorescentes verde amarillo brillante durante la inspección.

Bibliografía

• García, G. (1989). Manual de Métodos para el Análisis de Micotoxinas en granos. México, D.F. Programa Universitario de Alimentos.163pp.

• Shotwell, O. L. y C. W, Hesseltine.1981. Use of bright greenish yellow fluorescence as a presumptive test for aflatoxin in 1978 corn. Cereal Chem. 58: 124: 387.

1. Las micotoxinas deben ser manejadas como sustancias sumamente tóxicas.

2. Realizar todas las actividades dentro de una campana de gases.

3. Tomar precauciones especiales como el uso de bata, cubrebocas, lentes de seguridad y guantes, debido a que las toxinas están en forma seca, por su naturaleza electrostática, tienden a dispersarse en las áreas de trabajo.

4. Fregar los derrames accidentales de micotoxinas con NaOH al 1 %, dejar 10 min y agregar acetona acuosa al 5 %.

5. El laboratorio debe de disponer de un programa de recolección de residuos tóxicos, por motivos ambientales y de seguridad, es obligatorio que se depositen todos los residuos originados durante el análisis en recipientes debidamente señalizados: residuos orgánicos; residuos ácidos; residuos básicos; residuos sólidos. No se podrá verter ninguna sustancia peligrosa por el desagüe. Estos residuos son recogidos periódicamente por personal especializado y enviados a plantas especiales de tratamiento de residuos.

6. Lavar el material de cristalería. Remojar toda la cristalería expuesta a las aflatoxinas con MeOH, agregar una solución de NaOH al 1 %, después de 2 horas agregar 5 % de acetona al volumen total, dejar reaccionar 30 min, lavar perfectamente.